Bioteknologi Dan Kultur Jaringan

BIOTEKNOLOGI DAN KULTUR JARINGAN

Pengenalan Ruangan Lab dan Pengenalan Alat-Alat Lab Silvikultur Fakultas Kehutanan

Pengenalan Ruangan Laboratorium Kultur Jaringan.

Dalam kegiatan kultur jaringan masing-masing kegiatan harus terpisah satu dengan lainnya, dengan peralatan tersendiri. Karena kegiatan-kegiatan tersebut, maka ruangan yang dibutuhkan adalah :

a.       Ruang Persiapan

Ruang ini dipergunakan untuk mempersiapkan media kultur dan bahan tanaman yang akan dipergunakan, sebagai tempat mencuci alat-alat laboratorium, dan tempat menyimpan alat-alat gelas. Sesuai degan fungsinya maka yang dibutuhkan dalam ruangan ini adalah alat pemanas meja utnuk bekerja, dan tempat mencuci. Persiapan media meliputi penimbangan bahan, pengeceran media, penuangan kedalam wadah kultur, dan sterilisasi. Sedangkan persiapan bahan tanaman meliputi  pencucian kotoran-kotoran dari lapangan, pembuagan dan pemotongan bagian-bagian yang tidak diperlukan, serta perlakuan awall untuk mengurangi sumber kontaminasi yang ada pada permukaan bahan tanaman.

b.      Ruangan Timbang dan Penyimpanan Bahan Kimia

Dalam ruangan ini bahan-bahan kimia dasar untuk pembuatan media tanam kultur jaringan disimpan, juga untuk menimbang bahan-bahan yang akan dipergunakan. Maka di ruangan ini terdapat alat timbang Ohaus, pH meter dan lemari penyimpanan.

c.       Ruang Transfer

Merupakan ruang dimana pekerjaan asptik dimulai. Dalam ruangan ini dilakukan kegiatan isolasi bagian tanaman, strerilisasi, dan penanaman eksplan dalam media. Ruangan ini sedapat mungkin bebas dari debu dan hewan kecil, serta tersekat dari ruang lain. Pintu penghubung diusahakan selalu tertutup. Penggunaan AC sangat dianjurkan dalam ruang transfer. Ruang transfer ini sangat penting mempunyai pintu penghubung dengan ruang stok, dan ruang kultur. Ruanagan selalu dibersihkan dengan bahan disinfectant.

d.      Ruang Kultur

Biasanya merupakan ruang besar dengan kemungkinan perluasan bila diperlukan. Ruangan ini harus dijaga kebersihannya dan sedapat mungkin dihindari terlalu banyak keluar masuknya orang-orang yang tidak berkepentingan. Botol kultur biasa diatur pada rak-rak terbuka yang tersusun untuk menghemat area. Jarak antara tiap lapisan rak pada umumnya 40 – 50 cm. secara garis besar ruang kultur harus mempunyai pengaturan terhadap suhu dan cahaya. Cahaya  amat penting untuk pengendalian perkembangan eksplan. Dengan demikian penggunaan AC dan lampu fluorescent sangat penting, dalam ruangan kultur. Lampu fluorescent biasa digunakan dalam ruang kultur sebagai sumber cahaya. Karena lebih baik disbanding lampu pijar. Intensitas cahaya yang baik dari lampu fluorescent adalah antara 100 – 400 ft-c. pencahayaan diberi 24 jam terus menerus. Suhu dalam kultur antara 25 – 28 °C yang merupakan suhu ruangan normal. Suhu ruangan di daerah tropis dapat diturunkan dengan pemasangan AC. Pemakaian AC mutlak, karena ruang kultur merupakan ruang tertutup yang sedikit sekali mempunyai aliran udara bebas.

Pengenalan Alat-Alat Kultur Jaringan

Alat-alat yang digunakan untuk pembuatan kultur jaringan didalam lab silvikultur Fakultas Kehutanan adalah sebagai berikut :

Alat Enkas :

Digunakan untuk berbagi tujuan seperti mengeringkan bahan organik antara lain akar, batang daun dengan suhu 70⁰C-80⁰C. Agar bahan organik tidak rusak. Digunakan juga untuk sterilisasi alat-alat dan bahan seperti pasir dan tanah, dengan suhu ± 80⁰C menggunakan panas. Juga mengeringkan bahan penelitian seperti kadar air tanah dengan kering oven sekitar 105⁰C untuk tetap mempertahankan sterilisasinya.

 Autoclave eletrik:

Digunakan untuk mensterilkan media botol kultur dan alat-alat diseksi alat ini telah dilengkapi dengan pengatur suhu takanan dan waktu.cara penggunaannya adalah isi autocklve dengan air hingga mencapai antara lubang pada bagian dasarnya.letakan bahan media atau alat yang disterilkan yang sebelumnya dibungkus dengan kerrtas atau aluminium foil,tutup autoclave dan rapar dengan skrup pada bbagian samping-samping penutup .nyalahkan autoclave yang disambungkan dengan listrik.stel waktu pemanasan yang diinginkan.jika habis waktu pemanasan mattikan autoclave putar skrup yang terdapat pada bagian atas penutup sedikit saja hal ini bertujuan agar uap dalam autoclave keeluar berlahan-lahan.jika autoclave telah dingin/tidak panas baru penutup dapat dibuka dan dikeluarkan isinya.

Destilator : digunakan untuk menghasilkan/membuat air steril

Laminar Air Flow cabinet (LAFC)

Alat ini digunakan untuk menanam eksplan dan supkultur yang    mensyaratkan kondisi aseptic.LAFC pada prinsipnya adalah sebuah kotak atau ruangan kecil yang didalamnya dihembuskan udaraah yang bersih kontaminasi dari luar,sehingga udarah dapat ruangan tersebut berada dalam keadaan aseptic.untuk menghasilkan udara steril alat ini biasanya dilengkapi dengan sebuuah kipas.cara pemakaian alat ini yaitu nyalahkan lampu penerangan  terlebih dahulu semprotkan alcohol pada meja kerrja dan lab dengan tisu hinga bersih.nyalahkan kipas anginnya juga lampu UV untuuk beberapa menit kemudian matikan lampu ultraviolet sebelum laboran bekerja pada LAFC.Saat bekerja pada LAFC kipas anginnya terus dinylahkan,serta menyemprotkan alcohol 70% terlebih dahulu pada tangan kita.

Bowl Filler

Berfungsi untuk mengambil larutan dengan pipet ukur.untuk pemakaiannya,keluarkan terlebih dahulu udara dalam “bola”bowl filler dengan cara dari lingkaran A.lingkaran S ditekan untuk menyedot larutan dan E untuk mengeluarkan larutan berupa tetesan.

           

Timbangan Analitik

Berfungsi bsebagai alat mengukur berat bahan-bahan kimia yang akan digunakan dalam praktek atau kerja kultur jaringan.penggunaannya terlebih dahulu diperhatikan gelembung raksa pada timbangan harus berada dalam lingkaran merah.Wadah yang dipakai untuk menampung bahan yang ditimbang biasanya dengan kertas atau aluminium foil.

pH Meter:

Digunakan untuk mengetahui tingkat keasaman-kebasaan suatu larutan media yang dibuat.dalam penggunaannya harus menggunakan larutan buffer yang bersifat netral.pendeteksi pH dicetupkan pada larutan buffer kemudian dicelupkan pada larutan media yang dibuat.

Lemari Pendingin: Digunakan untuk manyimpan bahan-bahan kimia yang harus disimpan pada suhu rendah,juga alat-alat laboratorium yang steril.

Hot Plate:

Berfungsi sebagai pemanas.cara pemakaiannya dengan menyambungkan hot plate dengan listrik lalu atur suhu yang sesuai dengan keinginan kita.

Petridish, botol kultur dan tabungreaksi                                                                                

    Tabung reaksi                    botol kultur                           petridis

Digunakan sebagai wada media  tanam atau tempat tumbuhannya eksplan dalam kultur,ketiga harus dalam keadaan steril.untuk botol kultur dan tabung reaksi biasanya ditutup dengan kertas alminium foil.

Hand Spray

Berisi alcohol 70% berfungsi untuk menyemprot LAFC saat dibersihkan juga menyemprot alcohol di tangan kita saat mengerjakan transper eksplan.

Lampu Spirtus

 

Dipakai untuk mensterilkan alat-alat insekti.

Thermometer

Untuk mengukur suhu ruangan terutama ruangan kultur.

Rak Kultur

Untuk meletakan botol-botol kultur.rak ini dilengkapi dengan lampu fluorescent sebagai sumber cahaya.

Alat-alat diseksi, terdiri dari pinset, gunting dan pisau.

Digunakan untuk memotong bagian dari eksplan dan memindahkannya kedalam botol kultur dengan pinset. Semua alat-alat ini dengan pemakaiannya dicelupkan dalam betadine lalu dibakar dengan lampu spirtus, agar senantiasa steril.

Alat-alat gelas untuk membuat media kultur, berupa pipet, gelas ukur, gelas piala, labu Erlenmeyer dan pengaduk kaca.

Biasa digunakan untuk mengukur volume larutan yang dibutuhkan, serta sebagai wadah penyimpan larutan stok untuk media kultur. Harus diperhatikan secaramembaca takaran volume, mata laboran harus sejajar dengan garis takaran pada pipet atau gelas-gelas ukur lainnya. Pengaduk kaca berfungsi untuk mengaduk/mencampurkan larutan. Untuk pipet digunakan alat bantu Bowl foller.

AC

Berfungsi sebagai pendingin ruangan. Suhu dalam ruangan kultur berkisar 25 – 28⁰ C, dengan demkian AC dapat menurunkan suhu kamar yang tinggi.

Alat-alat pembersih botol kultur dan alat-alat gelas berupa sikat bullat berbagai ukuran. Digunakan untuk membantu menghilangkan kotoran yang melekat pada alat-alat- kultur jaringan. Juga berfungsi untuk mengeluarkan kotoran pada permukaan eksplan.

Sapu. Serok dan tempat sampah.

Berfungsih untuk membersihkan lantai ruangan laboratorium kultur jaringan.

Skema Laboratorium Silvikultur Fakultas Kehutanan Universitas Negeri Papua Manokwari

                                                                                                                                  

A

p

                                                                                               Meja kerja                                                   

                      papan tulis                                                                                                                       

B

                                                                                              

                                                                                              

                  meja

kursi                                               III                                           

                       

 

C

                       I

 

            

			E

 

D

                 KANTOR                                                                         

 

I

                                                                                                                i      

					M
	I

 

KULKAS

                        VI                       V                              IV

                  VII

 

Keterangan :

I.                   R.Penerima dan pemberian materi

II.                R.Persiapan dan Penyimpanan alat

III.             R.Timbang dan Penyimpanan Bahan Kimia

IV.             R.Penyimpanan Bahan Kimia

V.                R.Transfer

VI.             R.Transfer

VII.          R.Kultur

A.    Timbangan Ohaus

B.     pH meter

C.    Kulkas

D.    Rak Alat-Alat Gelas

E.     Wastafel

F.     Rak Botol Media dan Cawan Petri

G.    Autoclave

H.    Destilator

I.       Penampung Aquades

J.      Tempat Sampah

K.    Hot Plate

L.     Laminar Air FlowCabinet

M.   Rak Alat-Alat Gelas

Pembuatan Media

Meidia Stek.

Alat     : Ember,kertas,plastic,Hektar,Keranjang persemaian, pisau kater.

Bahan : Tanah ,pasir , komposisi

Cara Kerja :

Media yang digunakan untuk penanaman stek yaitu : pasir, tanah dan kompos. Pasir diambil sebanyak 10 ember yang berukuran kecil, tanah sebanyak 3 ember berukuran nkecil, dan kompos di ambil sebanyak 1 ember yang berukuaran kecil. Setelah media semua sudah di siapkan, kemudian media-media tersebut di gabungkan menjadi 1 lalu di ampur hingga semua media tersebut tercampur semua menjadi satu. Setelah media-media tersebut dicampur kemudia diisi kedalam plasitk bening dan kertas yang sudah di bentuk berukuran segi empat. Sesudah media tersebut di isi mkedalam plastik dan kertas, kemudia di bawa kedalam lab untuk di sterilisasikan.

Pasir yang diidi didalam plasitk, di sterilisasikan di dalam autoclave sedangkan pasir yang diisi kedalam kertas, disterilisasikan di dalam oven pengering (enkhas).

Pembuatan Sugkup.

Alat : Gunting, pisau karter, flakban, Lidi sapu, mistar ukur , baki, plastic     bening

Bahan : gabus 10 lembar

Cara Kerja  :

Gabus di potong sesuai dengan ukuran dengan panjang 35 cm dan lebar 15 cm sesuai dengan ukuran talang atau baki, kemudian di plakban dengan menggunakan plakban bening. Sesudah gabus di plakban kemudian di tutup dengan plastik bening. Pembuatan sungkup ini digukan untuk menutup tanaman stek yang di tanam didalam baki.

Pembuautan Media Cair da Media Padat.

Bahan : -  Mudah stek tdk menggunakan ZPT.

 -  Sulit stek menggunakan ZPT.

ZPT (Auksin) dalam bentuk padat(powder )

Bahan aktif:

- Nafta lenasetamida 0,067%

- metec –I Naftacenase tamida 0,013%

- metic-I Naflahen asetal 0,033%     

Indol   0,057%                                                                                                          

Tiram        4%

0,067%,0,013% dan 0,033% ketiga ini dari ZPT (Auksin)

ZPT padat :

IBA     = 25 mg

NAA   = 25 mg

Dithane           = 0,2%

Talk/ Bedak = 1mg/1 liter

                                  

Bahan yang kita perlukan :

Ø  50 g talk

Ø  25 g IBA

Ø  25 g NAA

Ø  0,1 g Dithane

Alat dan Bahan yang di gunakan yaitu:

♀   Alat           : Gelas ukur,cawan Petridis,botol kultur,timbangan analitik.

♀   bahan         : bedak,aquades,IBA,NAA dan Dithane.

Cara kerja:

1.      Timbang IBA sebanyak               0,025 g

2.      Timbang NAA sebanyak             0,025 g

3.      Timbang Dithane sebanyak             0,1  g

4.      Timbang Bedak/ Talk sebanyak  50 gr

5.      Untuk melarutkan IBA dan NAA caranya adalah menambahakan sedikit Alkohol 70 % dipanaskan hingga larut ditambahakan Air Aquades Sedikit, masukkan kedalam Talk. Sudah melarut baru Dithane menyusul biarkan beberapa hari supaya dia mengering menjadi bubuk baru kita gunakan.

ZPT (Auksin) yaitu dalam bentuk padat (powder), dan dalam beentuk cair (rootone).

Untuk menggunakan ZPT padat yaitu ZPT IBA/NAA sebanyak 500 ppm/500 ppm, carrier => menggunakan talk (bedak), bahan tambahan (Dhitane 0,2 %).

Bahan yang ditimbang yaitu 25 mg IBA + 25 mg NAA + 0,1 g Dithane. Tambahkan dengan alkohol 70%, talk (bedak) 50 g, dan air secukupnya.

Melarutkan IBA/NAA.

Menambnahkan sedikit alkohol 70 % dipanaskan hingga larut, tambahkan air sedikit, kemudian masukan talk.

Pembuatan ZPT Padat.

IBA dan NAA ditimbang sebanyak 0,025 g kemudian dilarutksn dengan alkohol 70% secukupnya dengan menambahkan air.

Kemudian dithane di timbang sebanyak 0,1 g dan talk di timbang sebanyak 50 g. Sesudah ditimbang kemudian campurkan dengan campuran IBA/NAA. Sesudah dicampur kemudian dimasukkan kedalam kulkas selama .....???? (Jika Diperlukan baru di keluarkan dari dalam kulkas)

Pembuatan ZPT Cair.

IBA dan NAA di timbang sebanyak 500 mg atau 0,5 g dan NAA 250 mg atau 0,25 g, sesudah di timbang di campur dengan air secukupnya, kemudian dilarutkan hingga merata, lalu di simpan di dalam kulkas.

Media Cair untuk Penanaman Stek.

Penyiapan ZPT

500 mg IBA   Alkohol 70%

250 mg NAA

0,5 –  IBA 0,25

Alat : Pengaduk, Timbangan, Labu Erlenmeyer, Cawan Petridis

Bahan : IBA, NAA, Air Aquades, Alkohol

Cara Kerja :

1.      Timbang IBA, NAA sebanyak  0,5/ 0,25 mg.

2.      Di masukkan kedalam Labu Erlenmeyer .

3.      Air Aquades dimasukkan kedalam Labu Erlenmeyer tambahkan Alkohol 70% kemudian dilarutkan.

Penanaman

Penyiapan Zat Pengatur Tumbuhan Untuk Stek.

Zat pengatur tumbuhan (ZPT) adalah senyawa organik alami maupun sentetik yang mampu sintetik dan bukan termasuk dalam unsur hara. Bertujuan sebagai pengatur pertumbuhan dan perkembangan tanaman. ZTP digolongkan kedalam auksin, sitokinin, giberelin (GA), etilen, dan asam abisik (ABA). ZPT yang umum digunakan adalah dari golongan auksin yang berguna untuk memicu terjadinya perakaran. Dari bentuknya maka ZPT tersebut dapat disiapkan dalam bentuk bubuk (powder), pasta, maupun cairan, sesuai cara pemberiannya pada tanaman seperti oles, celup cepat, maupun rendam.

Dalam kegiatan praktek yang kami lakukan adalah pembuatan ZPT dalam bentuk pasta, bubuk (powder) dan Cairan.

Penanaman Stek Insia Bijuga.

Pengambilan stek batang di ambil denga dua cara yaitu :

a.       Stek Buku Tunggal

b.      Stek  Buku Ganda.

Cara Penanaman :

Batang stek insia bijuga yang sudah di potong sesuai dengan ukuran yaitu ukuran buku tunggal dan buku ganda.

Stek Buku Tunggal

Stek buku tunggal dilakukan dengan tiga cara yaitu :

1.      Menggunakan pasta dengan cara di oles pada bagian batang bawah, kemudia di tanam didalam baki yang sudah berisi media stek yaitu pasir, tanah dan kompos. Sesudah ditanam kemudian ditutup degan sungkup yang terbuat dari gabus dan terbungkus dengan plastik bening, kemudian di bawah kedalam rumah kawat yang berada di belakangg lab silvikultur fakultas kahutanan.

2.      Mengguanakan air aquades dengan cara di oles pada bagian batang bawah, kemudia di tanam didalam baki yang sudah berisi media stek yaitu pasir, tanah dan kompos. Sesudah ditanam kemudian ditutup degan sungkup yang terbuat dari gabus dan terbungkus dengan plastik bening, kemudian di bawah kedalam rumah kawat yang berada di belakangg lab silvikultur fakultas kahutanan.

3.      Tanpa menggunakan ZPT yaitu batang stek yang sudah di potong di ambil lansung di tanam didalam baki yang sudah berisi media stek yaitu pasir, tanah dan kompos. Sesudah ditanam kemudian ditutup degan sungkup yang terbuat dari gabus dan terbungkus dengan plastik bening, kemudian di bawah kedalam rumah kawat yang berada di belakangg lab silvikultur fakultas kahutanan.

Stek Buku Ganda.

Stek buku ganda dilakukan sama seperti stek buku tuggal.

Penanaman Stek intsia bijuga Dengan Menggunakan Mendia cair.

1. Peralatan => Rakit => Di taruh Di Shaker/Aquarium Pump

2. Bahan Stek => Semai dari Intsia bijuga.

3. Media.

Ø  Nutrisi : MS => Makro dan Mikro

Ø  ZPT => IBA/NAA : 1ppm/1ppm

Ø  Air aqua.

4. Pembuatan Media Cair

Ø Larutan stok A ( NH₄ NO₃) 20 ml/l  X 3 ltr air => 60 ml/3 Ltr.

Ø Larutan Stok B ( KNO₃ ) 20 ml/l X 3 Ltr air => 60 ml/3 Ltr.

Ø Larutan Stok C ( CaCl₂ ) 10 ml/l X 3 Ltr air => 30 ml/ 3 Ltr.

Ø Larutan Stok d ( 2H₂O) 10 ml/l X 3 Ltr air => 30 ml/3 Ltr.

Ø Larutan Stok E ( Fe ) 5 ml/l X 3 Ltr air => 15 ml/ 3 Ltr.

Ø Larutan Stok F ( Mikro ) 5 ml/l X 3 Ltr air => 15 ml/3 Ltr.

Ø Air Aqua => 3 Liter

Ø NaOH/HCl => 2%

Masing –masing larutan di masukkan kedalam gelas ukur untuk mengukur larutan stok, kemudian di tuangkan kedalam gelas labu erlenmeyer, kemudian semua larutan tersebut di campur menjadi satu, sesudah dicampur menjadi satu, kemudin ditungkan kedalam baskom berukuran kecil, di tambahkan lagi dengan air aqua sebanyak 3 liter, dan NaOH/HCl 2%. Setelah semua larutan tercampur menjadi satu, kemudian mengukur pH, maka pH dari larutan atau media tersebut sebesar 6,5.

Bahan Stek.

Bahan stek yang di gunakan yaitu semai dari intsia bijuga, di ambil kemudian di potong sejarak 2 buku sebanyak 20 stek, kemudian di bawah ke lab, sesudah di lab, kemudian di masukkan atau di tancapkan di atas gabus yang sudah diberi lubang kemudian di lilit dengan kapas agar tidak terjatuh kedalam media, karena medianya adalah media cair. Sesudah ditancapkan di atas gabus, kemudian di taruh di dalam baskom yang sudah berisi media cair, lalu di taruh ddi atas shaker untuk di goyang atau di kocok dengan kecepatan shaker berkisan antara 100 – XX.

Induksi Tunas Apilkal.

 Bahan dan Alat

1. Pucuk tanaman berkayu Intsia bijuga (Matoa).

2. BAP

3. Bahan media MS

4. Laminar Air Flow

5. Diseccting set (Gunting, pinset, pisau)

6. Alkohol 70% dan 90%

7. Betadine

8. Fungisida dan Bakterida (2g/l)

9. Clorux/pemutih komersial (NaOCl 10%)

10. Petridish steril

11. Kertas saring/tissue steril

12. Air steril

Prosedur Kerja

1.      Media yang digunakan adalah media MS yang diperkaya dengan kinetin 2 mg/l, thiamin HCL 4mg/L; Myo-inositol 100 mg/L dengan pH 5.7.

2.      Explan berasal dari  pucuk pohon matoa yang tumbuh di halaman kampus pucuk-pucuk yang masih segar di bawah ke labolatorium silvikultur, dipotong bagian apikalnya dan dicuci bersih meggunakan deterjen yang diberi alkohol 20%.

3.      Explan disterilkan secara berseri dari larutan campuran fungisida dithane dan Agripth dengan dosis masing-masing  2 g/L selama 20 menit, dilanjutkan dengan perendaman dalam Clorox 10 % selama 10 menit, kemudian dalam air steril mengandung beberapa tetes betadine. Pada setiap seri sterilisasi  dilakukan pemotongan bagian-bagian eksplan yang tidak diperlukan sehingga diperoleh hanya bagian apikal dari explan tanaman diikuti dengan pembilasan dengan air steril setiap sterilisasi dilakukan pengocokan yang dapat dibantu dengan menggunakan alat penggojlk (shaker).

4.      Setelah sterilisasi, explan ditiriskan diatas kertas saring. Steril dalam petridish steril, eksplan tersebut dibiarkan sehinga betul-betul kering selanjutnya eksplan ditanam dalam media yang telah disiapkan.

5.      Eksplan yang telah disterilkan selanjutnya ditanam pada media embrio.

6.      Kultur potongan embrio selanjutnya disimpan ruangan kultur.

Kultur Jaringan

Kultur jaringan (Tissue Culture) merupakan suatu cara memperbanyak tanaman dengan teknik mengisolasi bagian tertentu dari tanaman seperti protoplasma, sel, jaringan dan organ serta menumbuhkannya pada media nutrisi yang mengandung zat pengatur tumbuh tanaman di dalam kondisi yang steril, sehingga bagian-bagian tersebut bisa memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman lengkap/sempurna. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbanyakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman melalui media buatan yang dilakukan di tempat steril.

Kultur jaringan atau biakan jaringan sering disebut kultur in vitro yakni teknik pemeliharaan jaringan atau bagian dari individu secara buatan yang dilakukan di luar individu yang bersangkutan. In vitro berasal dari bahasa Latin yang artinya "di dalam kaca". Jadi Kultur in vitro dapat diartikan sebagai bagian jaringan yang dibiakkan di dalam tabung inkubasi atau cawan petri dari kaca atau material tembus pandang lainnya.

Eksplan adalah bagian tanaman yang dipergunakan sebagai bahan awal untuk perbanyakan tanaman. Faktor eksplan yang penting adalah genotipe/varietas, umur eksplan, letak pada cabang, dan seks (jantan/betina). Bagian tanaman yang dapat digunakan sebagai eksplan untuk perbanyakan tanaman dengan metode kultur jaringan (kultur in vitro) adalah pucuk muda, batang muda, daun muda, kotiledon, hipokotil, endosperm, ovarymuda, anther, embrio, dan lain sebagainya.

Faktor-faktor yang mempengaruhi proses perbanyakan tanaman dengan metoda kultur jaringan, yaitu: 1) bagian tanaman yang dipergunakan sebagai bahan awal untuk dikulturkan; 2) Wadah dan media tumbuh yang steril. 3) Lingkungan tumbuh.
Media tumbuh untuk perbanyakan tanaman dengan kultur jaringan mengandung komposisi garam anorganik, zat pengatur tumbuh, dan bentuk fisik media. Media tersebut berfungsi untuk penyediaan air, hara mineral, vitamin, zat pengatur tumbuh, akses ke atmosfer untuk pertukaran gas, dan pembuangan sisa metabolisme tanaman pada proses regenerasi kultur jaringan (Kultur in vitro).

Umumnya jaringan dikulturkan pada media padat yang dibuat seperti gel dengan menggunakan agar (dari rumput laut) atau pengganti agar seperti Gelrite atau Phytagel (bersumber dari bakteri). Konsentrasi agar yang digunakan berkisar antara 0.7-1.0%. Pada konsentrasi tinggi agar menjadi sangat keras, sedikit sekali air yang tersedia, sehingga difusi hara ke tanaman sangat buruk. Di dalam media terkandung : 1> unsur-unsur mineral makro (Nitrogen (N) 25-60 mM, Kalium, Fosfor (P) 1-3 mM, Kalsium (Ca) 1-3 mM, Magnesium (Mg) 1-3 mM, Sulfur (S) 1-3 mM)); 2> unsur-unsur mikro (Besi (Fe) 1 m M, Mangan (Mn) 5-30 m M, Seng (Zn), Boron (B), Tembaga (Cu) 0.1 m M, Molybdenum (Mo) 1 m M, Cobalt (Co) 0.1 m M, Iodine (I) Nickel (Ni), aluminum (Al), and silicon (Si)); 3> senyawa organik (gula, sukrosa, dan lainnya) 20 to 40 g/l; 4> vitamin (thiamin (vitamin B1), nicotinic acid (niacin), pyridoxine (B6), dan myo-inositol); 4> arang aktif; dan 5> Zat pengatur tumbuh, yang bisa digunakan, yakni: dari golongan auksin seperti Indole Aceti Acid(IAA), Napthalene Acetic Acid (NAA), 2,4-D, CPA dan Indole Acetic Acid (IBA), golongan Sitokinin seperti Kinetin, Benziladenin (BA), 2I-P, Zeatin, Thidiazuron, dan PBA, dan golongan Gibberelin seperti GA3. Lingkungan tumbuh yang dapat mempengaruhi regenerasi tanaman meliputi pH, temperatur, panjang penyinaran, intensitas penyinaran, kualitas sinar, dan ukuran wadah kultur.

Persiapan.

-          Penyiapan Media

-          Penyiapan Alat dan Bahan

Penanaman.

Penanaman ini di lakukan didalam Laminar Air Flow

-          Alat => di sterilisasikan terlebih dahulu.

-          Bahan

·         Air Steril

·         Bahan Kimia ( untuk sterilisasi eksplan )

·         Clorox

·         Alkohol

·         HgCl2 (Air Raksa)

·         Betadhine

·         Fungisida (dithane) dan Bakterisida

Tahap-tahap pembuatan Kultur.

1.      Sterilisasi

2.      Prohferasi

3.      Pengakaran

4.      Aklimatisasi

Profesi tunas di aklimatisasikannkemudian di tanam didalam botol kultur.

Media yang digunakan.

Unsur Hara Makro.

Ø  KNO3                   1900 mg/l

Ø  NH4OO3              1650 mg/l

Ø  Kh2PO4                170 mg/l

Ø  CaCl2 2H2O         440 mg/l

Ø  Mg SO4 7H2O     370 mg/l

Ø  Vitamin

Ø  Thiamin-HCl         0,50 mg/l

Ø  Asam hikotinat      0,50 mg/l

Ø  Pyridoxin              0,50 mg/l

Ø  Myo-inositel          100 mg/l

Unsur Hara Mikro.

Ø  Fe SO4 7H2O                   27,8 mg/l

Ø  Na2 EDTA                        37, 3 mg/l

Ø  MnSO47H2O                   22,3 mg/l

Ø  ZnSO47H2O                    8,6 mg/l

Ø  H3BO3                             6,2 mg/l

Ø  Kl                                      0,83 mg/l

Ø  CuSo4H2O                       0,025 mg/l

Ø  NaMoO42H2O                 0,25 mg/l

Ø  CuCl2 6H2O                     0,025 mg/l

Larytan Stok Vitamin => Di pekatkan 100 X

Di buat 100 ml larutn stok

Komposisi untuk membuat media dasar MS (1L).

-          Asam Nikotinat (Nicotinik Acid) 0,5 mg/l => 500mg/100ml => 0,05g/100ml

-          Pyridoxin_HCl  0,5 mg/l   => 500mg/100ml=> 0,05g/100ml

-          Thiammin_HCl 0,1 mg/l   => 100mg/100ml=> 0,01g/100ml

-          Glycine 2,0 mg/l    => 200mg/100ml => 0,2g/100ml

Media Dasar MS.

Ø  Asam Nikotinat ditimbang sebesar 0,05 g / 100 ml

Ø  Thiamin_HCl di timbang sebesar 0,01 g / 100 ml

Ø  Pyridoxin_HCl ditimbang sebesar 0,05 g / 100 ml

Ø   Glycine di timbang sebesar 0,2 g / 100 ml

Setelah di timbang, masing-masing larutan semuanya dilrutkan dengan air aquades sedikit, sesudah dilarutkan kemudian dituangkan kedalam gelas erlenmeyer lalu di tambahkan dengan air aquades sebanyak 100 ml.

Lrutan Stok.

A.    (NH4 NO3)           =>        20 ml

B.     (KNO3)                 =>        20 ml

C.     (CaCl2)                 =>        10 ml

D.    (MgSO4 7H2O+KH2PO4+NaH2PO4H2O) => 10 ml

E.     (FeSO4 7H2O + Na2 EDTA) => 5 ml

F.      (mikro / Selain besi ) => 5 ml

Vitamin           =>        1 ml

Myo_Inositol  =>        100 mg /l  -> 0,1 g

Gula => 30 g/l

Masin-masing di ambil sesuai dengan ukuran ml, kemudian dituangkan kedalam gelas erlenmeyer, sesudah dituangkan kemudian ditambahkan lagi dengan larutan BAP2 dan BAP3.

Tahapan yang dilakukan dalam perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan adalah :

1.      Pembuatan media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca.

2.      Untuk pengambilan eksplan, bagian tanaman yang sering digunakan untuk kegiatan kultur jaringan adalah tunas.

3.      Lakukan sterilisasi yaitu segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Peralatan juga harus disterilkan dengan menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatann.

4.      Perbanyakan calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di laminar flow untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan. Tabung reaksi yang telah ditanami ekplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan suhu kamar.

5.      Pengamatan pada fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih atau biru (disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan bakteri).

6.      Pemindahan eksplan keluar dari ruangan aseptic ke bedeng. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan menggunakan sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap serangan hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya. Sungkup dilepaskan secara bertahap, selanjutnya pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan pada bibit generatif.

Perbanyakan Vegetatif Dengan Stek

Stek merupakan cara perbanyakan tanaman secara vegetatif buatan dengan  menggunakan sebagian batang, akar, atau daun tanaman untuk ditumbuhkan  menjadi tanaman baru. Sebagai alternarif perbanyakan vegetatif buatan, stek lebih ekonomis, lebih mudah, tidak memerlukan keterampilan khusus dan cepat  dibandingkan dengan cara perbanyakan vegetatif buatan lainnya. Cara perbanyakan dengan metode stek akan kurang menguntungkan jika bertemu dengan kondisi tanaman yang sukar berakar, akar yang baru terbentuk tidak tahan stress lingkungan dan adanya sifat plagiotrop tanaman yang masih bertahan.

Keberhasilan perbanyakan dengan cara stek ditandai oleh terjadinya regenerasi akar dan pucuk pada bahan stek sehingga menjadi tanaman baru yang true to name dan true to type. Regenerasi akar dan pucuk dipengaruhi oleh faktor intern yaitu tanaman itu sendiri dan faktor ekstern atau lingkungan. Salah satu faktor intern yang mempengaruhi regenerasi akar dan pucuk adalah fitohormon yang berfungsi sebagai zat pengatur tumbuh.

Boulline dan Went (1933) menemukan substansi yang disebut rhizocaline pada kotiledon, daun dan tunas yang menstimulasi perakaran pada stek. Menurut Hartmann et al (1997), zat pengatur tumbuh yang paling berperan pada pengakaran stek adalah Auksin. Auksin yang biasa dikenal yaitu indole-3-acetic acid (IAA), indolebutyric acid (IBA) dan nepthaleneacetic acid (NAA). IBA dan NAA bersifat lebih efektif dibandingkan IAA yang meruapakan auksin alami, sedangkan zat pengatur tumbuh yang paling berperan dalam pembentukan tunas adalah sitokinin yang terdiri atas zeatin, zeatin riboside, kinetin, isopentenyl adenin (ZiP), thidiazurron (TBZ), dan benzyladenine (BA atau BAP). Selain auksin, absisic acid (ABA) juga berperan penting dalam pengakaran stek.

Faktor intern yang paling penting dalam mempengaruhi regenerasi akar dan pucuk pada stek adalah faktor genetik. Jenis tanaman yang berbeda mempunyai kemampuan regenerasi akar dan pucuk yang berbeda pula. Untuk menunjang keberhasilan perbanyakan tanaman dengan cara stek, tanaman sumber seharusnya mempunyai sifat-sifat unggul serta tidak terserang hama dan/atau penyakit. Selain itu, manipulasi terhadap kondisi lingkungan dan status fisiologi tanaman sumber juga penting dilakukan agar tingkat keberhasilan stek tinggi.

Sambung/Garfting

Grafting dan Budding merupakan metode perbanyakan vegetatif buatan. Grafting/penyambungan adalah seni menyambungkan 2 jaringan tanaman hidup sedemikian rupa sehingga keduanya bergabung dan tumbuh serta berkembang sebagai satu tanaman gabungan. Teknik apapun yang memenuhi kriteria ini dapat digolongkan sebagai metode grafting. Sedangkan budding adalah salah satu bentuk dari grafting, dengan ukuran batang atas tereduksi menjadi hanya terdiri atas satu mata tunas (Hartmann et al, 1997). Tanaman sebelah atas disebut entris atau batang atas (scion), sedangkan tanaman batang bawah disebut understam atau batang bawah (rootstock) (Ashari, 1995). Batang atas berupa potongan pucuk tanaman yang terdiri atas beberapa tunas dorman yang akan berkembang menjadi tajuk, sedang batang bawah akan berkembang menjadi sistem perakaran (Hartmann et al, 1997).

Perbanyakan tanaman dengan cara grafting merupakan teknik perbanyakan yang mahal karena memerlukan banyak tenaga terlatih dan waktu. Teknik ini dipilih dengan pertimbangan untuk memperbanyak tanaman yang sukar/tidak dapat diperbanyak dengan cara stek, perundukan, pemisahan, atau dengan cangkok.

Isolasi Cendawan

pembibitan jamur budidaya seperti jamur tiram, jamur kuping dan jamur jenis lain dimulai dari pembuatan bibit kultur. Bibit ini dibuat dalam konsisi aseptik atau steril yang bebas dari kontaminasi alias tidak terdapat bakteri atau cendawan jenis lain yang tumbuh.

Jamur yang ingin dijadikan bibit diambil dari lapang atau alam kemudian bagian tubuhnya seperti batang, tudung atau lamelanya yang mengandung spora diambil sedikit dan diletakkan ke dalam media tumbuh. proses ini disebut isolasi.

Pada media ini bagian jamur tersebut akan beregenerasi atau berkembang sel-selnya membentuk hifa-hifa / benang-benang halus. Hifa akan menebal sehingga membentuk misellium berwarna putih. Tidak semua misellium jamur berwarna putih, tetapi pada umumnya misellium jamur budidaya berwarna putih.

Media tanam yang umum digunakan dalam isolasi jamur yaitu media PDA (Potato Dextrose Agar). Bentuk media ini seperti agar-agar makanan karena memang komposisinya terdiri dari agar. Selain media PDA proses isolasi biasa dipakai juga media MEA (Malt Extract Agar).

Cara Isolasi Cendawan

1. Sampel dicari dari lapang, yaitu tubuh buah jamur atau miselium jamur yang tumbuh pada sisa-sisa bahan organik yang melapuk.
2. Siapkan medium PDA yang diberi antibiotik kemicetin.
3. Medium ini dituang ke dalam cawan petri steril.
4. Bersihkan sampel tersebut dari tanah atau dari kotoran lain..
5. Secara aseptis sampel jamur dipotong kecil-kecil. Kalau badan buah cukup besar, ambil bagian yang paling dalam atau bagian yang tidak kontak dengan luar. Kalau sampelnya kecil, cukup dipotong-potong saja.
6. Secara aseptis masukkan potongan tubuh buah/miselium jamur tersebut ke dalam cawan yang telah berisi medium PDA. Buat beberapa kali ulangan, jangan hanya satu.
7. Inkubasi cawan tersebut dalam posisi terbalik.
8. Setiap hari diamati pertumbuhan jamur yang kita isolasi. Biasanya dalam waktu 2 -3 hari jamur sudah mulai tumbuh.
9. Segera pisahkan jamur tersebut ke dalam medium PDA yang lain. Ulangi langkah ini hingga diperoleh isolat jamur yang murni dan terbebas dari kontaminan. Biasanya pada sub kultur terakhir tidak dipakai antibiotik kemicetin.
10. Jamur yang sudah berhasil diisolasi segera diperbanyak dan disimpan.